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摘要：本文采用中性蛋白酶和flavourzyme分別水解脫脂小麥胚芽制取小麥胚芽水解物，研究兩種不同酶對麥胚蛋白水解速率的影響，同時通過測定水解物清除DPPH自由基的能力和還原能力研究麥胚蛋白水解物的抗氧化性。結(jié)果表明，中性蛋白酶對麥胚蛋白的水解速率明顯高于flavourzyme；兩種酶的水解產(chǎn)物均具有清除DPPH自由 基活性和還原能力。
關(guān)鍵詞：小麥胚芽蛋白酶水解DPPH自由基還原能力
中圖分類號：TS 201.2，TS 210.9文獻標識碼：A文章編號：1674-5280（2009）05-0044-04
衰老、癌癥及心血管等疾病被公認為與氧化應(yīng)激損傷及自由基代謝失調(diào)相關(guān)[1]，因此適當攝入具有抗氧化性的物質(zhì)可以抑制氧化的進行，幫助機體抵御疾病。目前市場上的抗氧化劑大多為人工合成的抗氧化劑，作用效果好，但化學(xué)合成物質(zhì)存在著安全隱患，因而篩選具有抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢。
研究表明，多種動植物蛋白及其水解物具有抗氧化功能，包括大豆蛋白[2]、菜籽蛋白[3]、米糠蛋白[4]和魚蛋白[5]等。
小麥胚芽營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量高達30%左右。麥胚蛋白是一種完全蛋白，含有人體必需的8種氨基酸，是一種天然的優(yōu)質(zhì)蛋白營養(yǎng)強化劑。麥胚蛋白質(zhì)中必需氨基酸的比值與FAO/WHO頒布的模式值基本接近，明顯優(yōu)于大米、面粉等谷物蛋白質(zhì)中必需氨基酸的構(gòu)成比例。
國內(nèi)外對麥胚蛋白及其水解物的研究主要集中于功能性質(zhì)[6-8]，對生理活性研究較少。Zhu等人的研究表明[9]，堿性蛋白酶水解麥胚蛋白制得的水解物具有抗氧化活性。本文采用中性蛋白酶及Flavourzyme兩種不同酶分別對小麥胚芽進行水解，并通過測定水解物清除DPPH自由基活性及還原能力研究其抗氧化活性。
1·材料與方法
1.1材料
小麥胚芽，青島賽麥隆食品有限公司；中性蛋白酶（15萬U/g），湖南尤特爾生化有限公司；
Flavourzyme 1000L（1000LAPU/g），諾維信公司。
1.2試劑及儀器
1.2.1試劑
正己烷，氫氧化鈉，鹽酸，三氯乙酸，鐵氰化鉀，磷酸，檸檬酸，硼酸等，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。
1.2.2儀器
LXJ-Ⅱ離心沉淀機：上海醫(yī)用儀器廠；PHS-3精密pH計：上海雷磁儀器廠；HH-20數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。
1.3實驗方法
1.3.1小麥胚芽脫脂
將小麥胚芽用其5倍量的正己烷浸提24 h，抽濾除去正己烷提取液，室溫放置除去溶劑得到脫脂小麥胚芽，過80目篩后備用。
1.3.2脫脂小麥胚芽的酶水解
將脫脂小麥胚芽和水加入到反應(yīng)容器中，置于水浴加熱至50℃，用4 N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再加入相應(yīng)蛋白酶于攪拌下水解，兩種酶的水解參數(shù)均為：基質(zhì)濃度5％（w/v），酶與基質(zhì)比3％，pH 7.0,反應(yīng)溫度50℃。反應(yīng)過程中加入4 mol/L的NaOH維持pH值恒定。反應(yīng)120 min后冷卻，將水解物在4℃，以4000×g離心20 min除去不溶物,收集上層清液立即加熱至85℃維持10min滅酶。冷凍干燥上層清液即得小麥胚芽水解物。
1.3.3水解度的測定方法
蛋白質(zhì)的水解度（DH）是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水解的百分數(shù)，其計算公式為：
DH%=（h/htot）×100，
式中h是每克蛋白中被水解的肽鍵的毫摩爾數(shù)，htot則是指每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)。本實驗采用pH-stat法測定水解過程中的水解度（DH）[10]，即根據(jù)水解過程中為保持反應(yīng)液pH值不變而加入的NaOH的量按下式計算水解度：
式中B為維持pH不變而加入的NaOH體積（m）l，Nb為NaOH濃度，Mp為蛋白質(zhì)的量（g），α為水解時α-NH2的平均離解度。
1.3.4清除DPPH自由基能力的測定[11]分別移取2.0 ml小麥胚芽水解物溶液和1.3×10-4 mol/L的DPPH甲醇溶液2.0 ml于具塞試管內(nèi)，搖勻，室溫避光反應(yīng)60 min后于517 nm測定吸光度Ai，同時測定2.0 ml的1.3×10-4mol/L DPPH甲醇溶液和2.0 ml蒸餾水混合后的吸光度A0，以及2.0 ml麥胚芽水解物和2.0 ml甲醇混合后的吸光度Aj，按下式計算小麥胚芽水解物對DPPH自由基的清除率：
1.3.5還原能力測定方法
按照Oyaizu的方法測定還原能力[12]。將小麥胚芽水解物溶解在0.2 mol/L，pH6.6的磷酸緩沖液中,取樣品液2.5ml加入試管，加入2.5ml1%（w/v）鐵氰化鉀溶液，混合物于50℃水浴保溫20 min后，快速冷卻，再加入2.5 ml的10％三氯乙酸溶液，混勻，以1500×g離心10 min，移取上清液2.5 ml于試管中依次加入2.5 ml蒸餾水、0.5 ml的0.1%FeCl3溶液，充分混勻，室溫靜置10 min后，測定700 nm處吸光度。吸光度越大表示還原能力越強。
2·結(jié)果與討論 2.1兩種蛋白酶水解脫脂小麥胚芽
兩種蛋白酶水解脫脂小麥胚芽的水解曲線見圖1。從圖1明顯可知，添加相同量的酶水解，中性蛋白酶對麥胚蛋白的水解速率明顯大于Flavourzyme。中性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，它可以從肽鏈內(nèi)部切斷其專一的肽鍵進行水解，而Flavourzyme是同時具有外切酶和內(nèi)切酶活性的復(fù)合酶，外切酶從肽鏈的一端逐步切斷相應(yīng)肽鍵進行水解，一般說來，內(nèi)切酶的水解速率較外切酶快，這可能也是本實驗中性蛋白酶對麥胚蛋白的水解速率大于Flavourzyme的原因。
由圖1可見，在反應(yīng)的前20 min，中性蛋白酶的水解速率較快，但隨著水解的進行，其水解速率逐漸減慢，至60 min左右時水解度曲線趨于平緩。這是因為中性蛋白酶是內(nèi)切酶，在反應(yīng)初期，大量的肽鍵可同時被其水解，但隨著水解時間的推移，水解液中可被蛋白酶水解的肽鍵的濃度逐漸減少，同時酶活性也會隨水解進程而逐漸減弱，加之酶本身也是蛋白質(zhì)，也有被水解的可能。Flavourzyme水解曲線在2 h水解過程中上升趨勢較平緩，顯然這與它所含外切酶有關(guān)。
表1顯示兩種酶分別水解2 h得到的脫脂小麥胚芽水解物的顏色及蛋白提取率，其中中性蛋白酶水解麥胚蛋白的蛋白提取率明顯比Flavourzyme的高。麥胚蛋白的溶解度與蛋白水解度有關(guān)，隨著水解度的增大，水解物的分子減小，其在水中的溶解度也相應(yīng)增加。從圖1可知，本實驗中性蛋白酶水解麥胚蛋白2h的水解度為18%，而Flavourzyme僅為4%，使得前者水解物的溶解度和蛋白提取率相應(yīng)提高了。中性蛋白酶與Flavourzyme水解物的顏色均為黃色，但深淺略有差異，可能與雜質(zhì)的不同變化有關(guān)。
2.2脫脂小麥胚芽水解物清除DPPH自由基能力
2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）是一種廣泛使用的穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517nm處有一個特征吸收峰，當存在自由基清除劑時，DPPH的孤對電子被配對，其顏色變?yōu)辄S色，517 nm處的吸光值減小，所以通過測定吸光度的減少可評價樣品清除DPPH自由基能力，此法簡便，靈敏且重現(xiàn)性好，常用于評價各種合成或天然樣品的抗氧化性。
圖2為兩種酶各自水解麥胚蛋白2 h的水解物對DPPH自由基的清除率。由圖2可知，兩種酶水解物均具有相似的清除DPPH自由基能力，且在一定濃度范圍內(nèi)（0~1.5 mg/mL），清除率隨著濃度的增加而明顯增大。蛋白水解物的抗氧化活性與水解產(chǎn)生的肽和氨基酸的組成、大小和數(shù)量有關(guān)，即酶的種類和水解度都會影響水解物結(jié)構(gòu)組成和抗氧化活性。
由圖3可知，VC清除DPPH自由基的活性大于本實驗制取的麥胚蛋白水解物，達到相同DPPH自由基清除率所需的VC的濃度明顯低于麥胚蛋白水解物。但小麥胚芽水解物是一種營養(yǎng)豐富的天然物質(zhì)，可以增加食品中的添加量提高抗氧化活性，它不僅沒有副作用還能改善食品的功能性質(zhì)。
2.3脫脂小麥胚芽水解物的還原能力
本文使用Oyaizu的方法通過測定樣品將Fe3+還原成Fe2+的能力評價水解物的還原能力。
由圖4可知，脫脂小麥胚芽兩種酶水解物的還原能力均隨著濃度的增加而增強，且與濃度幾乎成線性；兩種酶的水解物的還原能力差別不大，F(xiàn)lavourzyme水解物略大于中性蛋白酶水解物，該結(jié)果與兩種水解物清除DPPH自由基活性測定結(jié)果相似。
圖5顯示VC的還原能力與濃度基本呈線性關(guān)系，其還原能力也明顯高于脫脂小麥胚芽水解物的還原能力。水解物的還原能力是其提供氫原子或電子的能力，氫原子或電子能夠與DPPH自由基作用生成穩(wěn)定化合物，從這一點上講，兩種測定方法的結(jié)果有相似性是可能的。采用不同的測定方法有助于全面地評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性。
3·結(jié)論
本實驗分別使用Flvourzyme和中性蛋白酶水解脫脂小麥胚芽，當?shù)鞍酌赣昧肯嗤瑫r，中性蛋白酶水解速率較快，麥胚蛋白提取率較高。兩種酶的水解物都顯示出相似的清除DPPH自由基活性及還原能力。